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PCR技術(shù)的特點介紹

更新時間:2018-03-20      點擊次數(shù):7504
1、有一定程度單核苷酸錯誤摻入
    TaqDNA聚合酶缺少3’-5’核酸外切酶活性,因而不能糾正反應(yīng)中發(fā)生的核苷酸錯誤摻人;與大腸桿菌聚合酶IKlenow片段相比較,用TaqDNA聚合酶的反應(yīng)錯誤摻人相對多些。但在PCR擴(kuò)增過程中,其錯配率一般只有約1/萬,足可以供特異性分析。
2、操作簡便、快速
    目前國內(nèi)外已有多種類型的PCR擴(kuò)增儀,只需把反應(yīng)材料按一定濃度混合,置于儀器內(nèi),反應(yīng)便按所輸入的程序進(jìn)行。整個PCR操作過程,從標(biāo)本處理、PCR擴(kuò)增到產(chǎn)物分析,可在4h內(nèi)完成全部實驗。擴(kuò)增產(chǎn)物可直接供作序列分析和分子克隆,擺脫繁瑣的基因分析方法;可直接從總RNA或DNA中或部分DNA已降解的樣品中分離目的基因,省去須先進(jìn)行克隆后再作序列分析的模式。已固定和包埋的組織或切片亦可用于檢測。
3、對起始材料質(zhì)量要求低
    PCR技術(shù)對擴(kuò)增樣品的要求不高,僅含極微量目的DNA(pg、ng)、DNA粗制樣品或者總RNA,都可用做起始材料來獲得較多的目的產(chǎn)物。擴(kuò)增樣品既可以是純化的,也可以是粗制的;既可以是新鮮組織,也可以是陳舊樣品;既可以是細(xì)胞,也可以是體液;既可以是完整的大分子,也可以是部分降解的DNA。
4、可擴(kuò)增RNA或cDNA
    先按通常方法用寡脫氧核苷酸引物和反轉(zhuǎn)錄酶將mRNA轉(zhuǎn)錄成主鏈cDNA,再將得到的單鏈cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。即使mRNA轉(zhuǎn)錄片段只有cDNA中的0.01%,也能經(jīng)PCR擴(kuò)增出10倍242bp對長度的特異性片段。有些外顯子分散在一段很長的DNA中,難于將整段DNA大分子擴(kuò)增和做序列分析。若以mRNA作為模板,則可將外顯子集中,用PCRl次便完成對外顯子的擴(kuò)增并進(jìn)行序列分析。
5、特異性強(qiáng)
    自從提取出耐熱TaqDNA聚合酶以來,在熱變性處理時不被消化、不必在每次循環(huán)擴(kuò)增中再加入新酶,以及在較高溫度下連續(xù)反應(yīng),顯著提高了PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性。PCR擴(kuò)增的特異性還依賴于兩個引物設(shè)計的好壞,依賴于引物與模板結(jié)合的正確性。PCR反應(yīng)時退火溫度對特異性也有影響,一般來說,退火溫度越高,擴(kuò)增的特異性越好。高溫啟動法也可增加PCR擴(kuò)增的特異性,即通過在高溫(70℃)下加入某些必需因子(DNA聚合酶、模板DNA、Mg2+或引物等),使TaqDNA聚合酶僅在反應(yīng)達(dá)到較高溫度(>70℃)時才發(fā)揮作用。其他因素如酶濃度、dNTP、Mg2+、pH值等對PCR的特異性也有一定的影響。
6、敏感性高
    PCR產(chǎn)物的生成以指數(shù)方式增加,能將極微量的靶DNA成百萬倍以上地擴(kuò)增到足夠檢測分析量的DNA,它可對單拷貝基因、單個細(xì)胞、單根頭發(fā)、一滴血等微量標(biāo)本進(jìn)行分析。
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